Barcode nukleotida terpasang untuk memandu RNA secara unik mengidentifikasi gen pengatur – ScienceDaily

Barcode nukleotida terpasang untuk memandu RNA secara unik mengidentifikasi gen pengatur – ScienceDaily

[ad_1]

CRISPR-Cas9 memudahkan untuk melumpuhkan atau mengubah satu gen untuk menentukan pengaruhnya pada suatu organisme atau sel, atau bahkan gen lain. Tetapi bagaimana jika Anda dapat melakukan beberapa ribu percobaan sekaligus, menggunakan CRISPR untuk mengubah setiap gen dalam genom secara individual dan dengan cepat melihat dampak masing-masing?

Sebuah tim dari University of California, Berkeley, ilmuwan telah mengembangkan cara mudah untuk melakukan hal itu, memungkinkan siapa saja untuk membuat profil sebuah sel, termasuk sel manusia, dan dengan cepat menentukan semua urutan DNA dalam genom yang mengatur ekspresi gen tertentu.

Meskipun teknik ini sebagian besar akan bermanfaat bagi para peneliti dasar yang tertarik untuk melacak aliran aktivitas genetik – jaringan genetik – yang memengaruhi gen yang mereka minati, teknik ini juga akan membantu para peneliti dengan cepat menemukan urutan pengaturan yang mengontrol gen penyakit dan mungkin menemukan target baru untuk narkoba.

“Penyakit di mana Anda mungkin ingin menggunakan pendekatan ini adalah kanker, di mana kita mengetahui gen tertentu yang diekspresikan oleh sel kanker tersebut, dan perlu diekspresikan, untuk bertahan dan tumbuh,” kata Nicholas Ingolia, profesor molekul dan sel UC Berkeley. biologi. “Apa yang bisa dilakukan alat ini adalah mengajukan pertanyaan: Apa gen hulu, pengatur apa yang mengendalikan gen yang kita ketahui?”

Pengontrol tersebut mungkin lebih mudah ditargetkan secara terapeutik untuk mematikan sel kanker.

Teknik baru ini menyederhanakan sesuatu yang selama ini sulit dilakukan: menelusuri jalur genetik di dalam sel untuk menemukan pengendali utama ini.

“Kami memiliki banyak cara bagus untuk maju,” katanya. “Ini adalah cara yang bagus untuk bekerja mundur, mencari tahu apa yang ada di hulu sesuatu. Saya pikir ini memiliki banyak kegunaan potensial dalam penelitian penyakit.”

“Saya terkadang menggunakan analogi bahwa saat kita masuk ke ruangan gelap dan menyalakan sakelar, kita dapat melihat cahaya apa yang dinyalakan. Cahaya itu seperti gen, dan kita tahu, saat kita mematikan sakelar, gen apa itu menyala. Kami sudah sangat ahli dalam hal itu, “tambahnya. “Apa yang memungkinkan kami melakukannya adalah bekerja mundur. Jika kami memiliki lampu yang kami pedulikan, kami ingin mencari tahu sakelar apa yang mengendalikannya. Ini memberi kami cara untuk melakukannya.”

Ryan Muller, seorang mahasiswa pascasarjana di laboratorium Ingolia, dan rekan Lucas Ferguson dan Zuriah Meacham, bersama dengan Ingolia, akan mempublikasikan rincian teknik mereka secara online pada 10 Desember di jurnal tersebut. Ilmu.

Barcode genom

Sejak munculnya penyuntingan gen CRISPR-Cas9 delapan tahun lalu, para peneliti yang ingin menentukan fungsi gen tertentu telah mampu secara tepat menargetkannya dengan protein Cas9 dan melumpuhkannya. Dipandu oleh sepotong RNA pemandu yang melengkapi DNA dalam gen, protein Cas9 mengikat gen dan memotong atau, seperti halnya gangguan CRISPR (CRISPRi), menghambatnya.

Dalam jenis pengujian yang paling kasar, sel atau organisme hidup atau mati. Namun, mungkin untuk mencari efek yang lebih halus dari knockout, seperti apakah gen tertentu dihidupkan atau dimatikan, atau seberapa banyak gen itu dinaikkan atau diturunkan.

Saat ini, hal itu memerlukan penambahan gen reporter – sering kali yang mengkode protein fluoresen hijau – yang dilampirkan pada salinan identik promotor yang memulai ekspresi gen yang Anda minati. Karena promotor unik setiap gen menentukan kapan gen tersebut dinyatakan, jika sistem gugur Cas9 memengaruhi ekspresi gen yang Anda minati, itu juga akan memengaruhi ekspresi pelapor, membuat budaya bersinar hijau di bawah cahaya fluoresen.

Namun demikian, dengan total 6.000 gen dalam ragi – dan 20.000 total gen pada manusia – merupakan upaya besar untuk mengubah setiap gen dan menemukan efeknya pada reporter fluoresen.

“CRISPR membuatnya mudah untuk mensurvei secara komprehensif semua gen dalam genom dan mengganggunya, tetapi pertanyaan besarnya adalah, Bagaimana Anda membaca efek dari masing-masing gangguan itu?” dia berkata.

Teknik baru ini, yang oleh Ingolia disebut interferensi CRISPR dengan pengurutan reporter ekspresi barcode, atau CiBER-seq, memecahkan masalah itu, memungkinkan eksperimen ini dilakukan secara bersamaan dengan mengumpulkan puluhan ribu eksperimen CRISPR. Teknik ini menghilangkan fluoresensi dan menggunakan pengurutan dalam untuk secara langsung mengukur peningkatan atau penurunan aktivitas gen di kolam. Pengurutan dalam menggunakan teknologi pengurutan generasi berikutnya dengan throughput tinggi dan terbaca lama untuk mengurutkan dan pada dasarnya menghitung semua gen yang diekspresikan dalam sampel yang dikumpulkan.

“Dalam satu eksperimen CiBER-seq yang dikumpulkan, dalam satu hari, kami dapat menemukan semua pengatur hulu untuk beberapa gen target yang berbeda, sedangkan, jika Anda menggunakan teknik berbasis fluoresensi, masing-masing target tersebut akan membutuhkan waktu pengukuran beberapa hari. waktu, “kata Ingolia.

CRISPRing setiap gen dalam suatu organisme secara paralel sangat mudah, berkat perusahaan yang menjual RNA panduan tunggal siap pakai untuk digunakan dengan protein Cas9. Para peneliti dapat memesan sgRNA untuk setiap gen dalam genom, dan untuk setiap gen, selusin sgRNA berbeda – kebanyakan gen adalah untaian ribuan nukleotida, sedangkan sgRNA memiliki panjang sekitar 20 nukleotida.

Inovasi utama tim adalah menghubungkan setiap sgRNA dengan urutan nukleotida acak yang unik – pada dasarnya, kode batang – terhubung ke promotor yang hanya akan mentranskripsikan kode batang jika gen yang diinginkan juga diaktifkan. Setiap kode batang melaporkan efek satu sgRNA, secara individual menargetkan satu gen dari kumpulan ribuan sgRNA yang kompleks. Pengurutan dalam memberi tahu Anda kelimpahan relatif dari setiap kode batang dalam sampel – untuk ragi, sekitar 60.000 – memungkinkan Anda untuk menilai dengan cepat mana dari 6.000 gen dalam ragi yang berpengaruh pada promotor dan, dengan demikian, ekspresi gen yang diinginkan . Untuk sel manusia, seorang peneliti mungkin memasukkan lebih dari 200.000 RNA panduan berbeda, menargetkan setiap gen beberapa kali.

“Ini benar-benar inti dari apa yang dapat kami lakukan secara berbeda: gagasan bahwa Anda memiliki perpustakaan besar RNA pemandu yang berbeda, yang masing-masing akan mengganggu gen yang berbeda, tetapi memiliki promotor kueri yang sama di atasnya – respon yang kalian pelajari. Itu query promotor mentranskripsikan barcode acak yang kita link ke masing-masing guide, ”ujarnya. “Jika ada respons yang Anda pedulikan, Anda menyodok setiap gen yang berbeda dalam genom dan melihat bagaimana respons itu berubah.”

Jika Anda mendapatkan satu kode batang yang 10 kali lebih banyak daripada yang lainnya, misalnya, yang memberi tahu Anda bahwa promotor kueri diaktifkan 10 kali lebih kuat di sel itu. Dalam praktiknya, Ingolia menempelkan sekitar empat kode batang berbeda ke setiap RNA panduan, sebagai pemeriksaan empat kali lipat pada hasil.

“Dengan melihat lebih langsung pada respons ekspresi gen, kita dapat menangkap banyak hal halus dari fisiologi itu sendiri, apa yang terjadi di dalam sel,” katanya.

Dalam percobaan yang baru dilaporkan, tim mempertanyakan lima gen terpisah dalam ragi, termasuk gen yang terlibat dalam metabolisme, pembelahan sel, dan respons sel terhadap stres. Meskipun dimungkinkan untuk mempelajari hingga 100 gen secara bersamaan saat CRISPRing seluruh genom, ia menduga bahwa, demi kenyamanan, para peneliti akan membatasi diri pada empat atau lima gen sekaligus.

Pekerjaan itu didanai oleh National Institutes of Health (DP2 CA195768, R01 GM130996).

Untuk Informasi Lebih lanjut silahkan Kunjungi : Lagu Togel

Author Image
adminProzen