Pengujian malaria berbasis CRISPR dengan cepat – ScienceDaily

Pengujian malaria berbasis CRISPR dengan cepat – ScienceDaily


Untuk mencapai tujuan pemberantasan malaria yang ditetapkan oleh Program Pengendalian Malaria Global Organisasi Kesehatan Dunia (WHO), sangat penting bahwa semua penularan lokal parasit malaria di wilayah geografis tertentu diberantas. Salah satu landasan penting pada jalur ini adalah pengembangan kemampuan diagnostik yang cepat, sensitif, dan spesifik spesies yang berguna di rangkaian sumber daya rendah (LRS) di banyak daerah dengan malaria endemik.

Saat ini, keberadaan empat spesies Plasmodium utama penyebab malaria P. falciparum, P. vivax, P. ovale, dan P. malariae ditentukan dengan analisis mikroskopis sampel darah di mana parasit dapat dideteksi dalam sel darah merah, atau dengan yang disebut tes diagnostik cepat untuk protein Plasmodium spesifik (antigen).

“Sayangnya, pendekatan diagnostik cepat yang tersedia tidak dapat membedakan keempat spesies Plasmodium satu sama lain, yang dapat menjadi penting untuk memulai pengobatan definitif, dan, yang paling penting, pendekatan tersebut tidak efektif untuk mendeteksi sejumlah kecil parasit Plasmodium pada individu tanpa gejala,” kata Nira Pollock, MD, Ph.D., Associate Medical Director of Boston Children’s Hospital’s Infectious Diseases Diagnostic Laboratory dan Associate Professor of Pathology and Medicine di Harvard Medical School. “Ini” pembawa asimtomatik “adalah reservoir diam untuk penularan terus menerus oleh nyamuk penyebar malaria dan sangat penting untuk upaya global berkelanjutan untuk memberantas malaria,” tambah Jeffrey Dvorin, MD, Ph.D., Associate Professor of Pediatrics di Harvard Medical School and Senior Dokter Asosiasi dalam Penyakit Menular di Rumah Sakit Anak Boston.

Sekarang, kolaborasi penelitian multi-disiplin yang dipimpin oleh anggota Wyss Core Faculty James Collins, Ph.D. di Harvard’s Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering dan Massachusetts Institute of Technology (MIT), dan dirakit oleh rekan klinis Rose Lee, MD, MSPH, yang juga termasuk Pollock dan Dvorin, membuat uji diagnostik ultrasensitif yang dapat diterapkan di lapangan yang secara khusus mendeteksi DNA urutan dari semua spesies Plasmodium pada malaria bergejala dan asimtomatik. Metode diagnostik malaria baru menggabungkan protokol persiapan sampel cepat 10 menit yang dioptimalkan dengan sistem SHERLOCK berbasis CRISPR untuk memungkinkan deteksi Plasmodium yang sangat spesifik dan sensitif dalam 60 menit lagi di perangkat pelapor sederhana. Itu diterbitkan di PNAS.

“Alat tes diagnostik malaria SHERLOCK yang siap di lapangan ini melampaui persyaratan sensitivitas dan spesifisitas yang ditetapkan oleh WHO untuk tes yang diinginkan yang dapat digunakan untuk mendeteksi kepadatan parasit yang rendah pada pembawa asimtomatik dari semua spesies Plasmodium utama,” kata anggota Fakultas Inti Pendiri Wyss, James Collins. , Ph.D. “Rancangannya yang sangat efisien dapat memberikan solusi yang layak untuk kemacetan diagnostik saat ini di jalur untuk memberantas malaria, dan lebih umum memungkinkan pengawasan malaria di rangkaian sumber daya rendah.” Collins adalah pemimpin Area Fokus Perangkat Seluler Hidup Institut, dan juga Profesor Termeer dari Teknik & Sains Medis di MIT.

Tim peneliti mendemonstrasikan alat uji SHERLOCK (kependekan dari Specific High -ensitivity Enzymatic Reporter unLOCKing) yang mampu mendeteksi kurang dari dua parasit per mikroliter darah, WHO menyarankan “batas deteksi” (LOD) untuk tes dengan kegunaan luas. di daerah endemis. Menunjukkan potensi klinis pengujian dengan menganalisis sampel klinis yang mengandung spesies P. falciparum dan P. vivax, mereka memanggilnya dengan sensitivitas 100%, dengan mengidentifikasi sampel positif yang benar, dan spesifisitas 100%, dengan mengidentifikasi sampel yang tidak memiliki Plasmodium tertentu dengan benar. spesies dalam sampel negatif benar. Sensitivitas dan spesifisitas yang mendekati 100% adalah atribut utama dari uji diagnostik yang akan digunakan dalam pengujian dunia nyata. Selain itu, pengujian dirancang sedemikian rupa sehingga juga dapat menentukan keberadaan strain P. falciparum yang sering bermutasi yang telah kehilangan antigen HRP2 dan dengan demikian lolos dari deteksi dengan uji diagnostik cepat yang umum.

Kelompok Collins di Wyss Institute dan MIT bersama-sama mengembangkan teknologi SHERLOCK dengan kelompok Feng Zhang di Broad Institute. Itu dilisensikan kepada Sherlock Biosciences, sebuah startup yang menggunakannya untuk membuat diagnostik molekuler cepat untuk aplikasi penyakit lain, dan baru-baru ini menerima otorisasi penggunaan darurat dari FDA untuk diagnostik cepat COVID-19.

Metode lain telah dikembangkan yang, seperti uji SHERLOCK baru, memperkuat dan mendeteksi bahan asam nukleat DNA (atau RNA) spesies Plasmodium. Namun, hingga saat ini, metode ini tetap dibatasi oleh kebutuhan mereka akan peralatan laboratorium yang mahal, seperti dalam kasus metode berbasis polymerase chain reaction (PCR), teknik persiapan sampel yang rumit, dan personel terlatih atau, seperti dalam kasus “isotermal” yang lebih sederhana. “Metode amplifikasi dilakukan pada satu suhu, mereka belum menunjukkan kepekaan yang diinginkan di lapangan.

Uji malaria SHERLOCK memanfaatkan enzim CRISPR-Cas12a yang dapat diprogram untuk menjadi aktif dengan apa yang disebut RNA pemandu yang mengikat urutan target asam nukleat target tertentu, dalam hal ini urutan dari salah satu dari empat spesies Plasmodium. Cas12a yang diaktifkan kemudian secara non-khusus membelah untai DNA beruntai tunggal di sekitarnya dengan tingkat pergantian yang sangat tinggi sekitar 1.250 reaksi pembelahan kolateral per detik. Para peneliti memanfaatkan aktivitas penguatan ini dalam pengujian mereka dengan mengintegrasikannya dengan preparasi sampel yang dioptimalkan, yang tidak memerlukan langkah ekstraksi nukleat spesifik seperti beberapa tes amplifikasi asam nukleat lainnya (NAAT), dan amplifikasi isotermal dari rangkaian DNA dan RNA Plasmodium spesifik di paling depan. Panduan RNA yang mengenali motif spesifik spesies dalam sekuens Plasmodium yang diperkuat kemudian melepaskan aktivitas Cas12a, yang secara bersama-sama menyerang sekuens pelapor DNA beruntai tunggal yang produk pembelahannya membantu memberi sinyal adanya asam nukleat spesifik patogen. Di bagian belakang pengujian, sinyal direkayasa untuk menyebabkan perubahan fluoresensi di perangkat genggam, atau pita spesifik pada strip aliran lateral yang biasa digunakan di perangkat tempat perawatan klinis.

“Yang penting, pengujian ini kompatibel dengan jenis sampel yang berbeda, seperti darah utuh, plasma, serum, dan darah kering, dan semua komponen yang diperlukan untuk amplifikasi, aktivasi Cas12a dan pembuatan sinyal dapat diliofilisasi dalam satu tabung reaksi untuk bekerja sama dalam a reaksi satu-pot setelah mereka dibentuk kembali dan dicampur dengan sampel pasien, “kata penulis pertama Rose Lee, seorang rekan klinis di kelompok Collins dan Rumah Sakit Anak Boston dengan minat yang kuat dalam diagnosis penyakit menular dan berperan penting dalam merakit multi- tim disiplin bersama dengan Collins. “Ini menghindari keharusan bergantung pada rantai dingin fungsional dan memungkinkan pengujian dilakukan dalam pengaturan sumber daya rendah dengan keahlian minimal.”

“Uji molekuler kolaborasi untuk diagnosis malaria menunjukkan cara di mana kapabilitas Wyss Institute di bidang biologi sintetik, bila dipasangkan dengan keahlian dalam biologi dan epidemiologi penyakit menular, dapat mengubah jalannya penyakit yang benar-benar melemahkan yang melumpuhkan populasi besar di seluruh dunia,” kata Direktur Pendiri Wyss Institute Don Ingber, MD, Ph.D., yang juga merupakan Profesor Biologi Vaskular Judah Folkman di Sekolah Kedokteran Harvard dan Rumah Sakit Anak Boston, dan Profesor Rekayasa Biologi di Sekolah Teknik dan Teknik Harvard John A.Paulson Ilmu Terapan.

Untuk Informasi Lebih lanjut silahkan Kunjungi : HK Prize

Author Image
adminProzen