Orgasme yang Segera Terjadi Pada Wanita Berhubungan Dengan Kaki Gelisah - ScienceDaily

Teknik pengeditan gen baru memungkinkan jutaan eksperimen genetik dilakukan secara bersamaan – ScienceDaily


Para peneliti telah menciptakan alat pengeditan gen baru yang disebut Retron Library Recombineering (RLR) yang dapat menghasilkan hingga jutaan mutasi secara bersamaan, dan ‘barcode’ sel bakteri mutan sehingga seluruh kumpulan dapat disaring sekaligus. Ini dapat digunakan dalam konteks di mana CRISPR beracun atau tidak layak, dan menghasilkan tingkat pengeditan yang lebih baik.

Meskipun sistem pengeditan gen CRISPR-Cas9 telah menjadi anak poster inovasi dalam biologi sintetik, ia memiliki beberapa keterbatasan utama. CRISPR-Cas9 dapat diprogram untuk menemukan dan memotong potongan DNA tertentu, tetapi mengedit DNA untuk membuat mutasi yang diinginkan memerlukan trik sel agar menggunakan potongan DNA baru untuk memperbaiki kerusakan. Umpan-dan-sakelar ini bisa rumit untuk diatur, dan bahkan bisa menjadi racun bagi sel karena Cas9 sering memotong situs yang tidak diinginkan dan di luar target juga.

Teknik penyuntingan gen alternatif yang disebut rekombinasi sebagai gantinya melakukan umpan-dan-beralih ini dengan memperkenalkan potongan DNA alternatif sementara sel mereplikasi genomnya, secara efisien menciptakan mutasi genetik tanpa merusak DNA. Metode ini cukup sederhana sehingga dapat digunakan di banyak sel sekaligus untuk membuat kumpulan mutasi yang kompleks untuk dipelajari oleh para peneliti. Mencari tahu apa efek dari mutasi tersebut, bagaimanapun, mengharuskan setiap mutan diisolasi, diurutkan, dan dikarakterisasi: tugas yang memakan waktu dan tidak praktis.

Para peneliti di Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering di Harvard University dan Harvard Medical School (HMS) telah menciptakan alat pengeditan gen baru yang disebut Retron Library Recombineering (RLR) yang membuat tugas ini lebih mudah. RLR menghasilkan hingga jutaan mutasi secara bersamaan, dan “barcode” sel mutan sehingga seluruh kumpulan dapat disaring sekaligus, memungkinkan sejumlah besar data untuk dengan mudah dihasilkan dan dianalisis. Pencapaian tersebut, yang telah dicapai dalam sel bakteri, dijelaskan dalam makalah terbaru di PNAS.

“RLR memungkinkan kami melakukan sesuatu yang tidak mungkin dilakukan dengan CRISPR: kami secara acak memotong genom bakteri, mengubah fragmen genetik tersebut menjadi DNA untai tunggal secara in situ, dan menggunakannya untuk menyaring jutaan urutan secara bersamaan,” kata penulis pendamping pertama. Max Schubert, Ph.D., seorang postdoc di laboratorium anggota Fakultas Inti Wyss George Church, Ph.D. “RLR adalah alat pengeditan gen yang lebih sederhana dan lebih fleksibel yang dapat digunakan untuk eksperimen yang sangat multipleks, yang menghilangkan toksisitas yang sering diamati dengan CRISPR dan meningkatkan kemampuan peneliti untuk mengeksplorasi mutasi pada tingkat genom.”

Retron: dari teka-teki hingga alat teknik

Retron adalah segmen DNA bakteri yang menjalani transkripsi balik untuk menghasilkan fragmen DNA untai tunggal (ssDNA). Keberadaan retron telah diketahui selama beberapa dekade, tetapi fungsi ssDNA yang mereka hasilkan para ilmuwan yang bingung dari tahun 1980-an hingga Juni 2020, ketika sebuah tim akhirnya menemukan bahwa retron ssDNA mendeteksi apakah virus telah menginfeksi sel, membentuk bagian dari kekebalan bakteri. sistem.

Sementara retron pada awalnya dilihat hanya sebagai permainan misterius bakteri, para peneliti menjadi lebih tertarik pada mereka selama beberapa tahun terakhir karena mereka, seperti CRISPR, dapat digunakan untuk pengeditan gen yang tepat dan fleksibel pada bakteri, ragi, dan bahkan sel manusia.

“Untuk waktu yang lama, CRISPR hanya dianggap sebagai hal aneh yang dilakukan bakteri, dan mencari cara memanfaatkannya untuk rekayasa genom mengubah dunia. Retron adalah inovasi bakteri lain yang mungkin juga memberikan beberapa kemajuan penting,” kata Schubert. Ketertarikannya pada retron terusik beberapa tahun lalu karena kemampuannya menghasilkan ssDNA pada bakteri – fitur menarik untuk digunakan dalam proses pengeditan gen yang disebut rekombinasi oligonukleotida.

Teknik pengeditan gen berbasis rekombinasi memerlukan pengintegrasian ssDNA yang mengandung mutasi yang diinginkan ke dalam DNA organisme, yang dapat dilakukan dengan salah satu dari dua cara. DNA beruntai ganda dapat dipotong secara fisik (dengan CRISPR-Cas9, misalnya) untuk mendorong sel agar memasukkan urutan mutan ke dalam genomnya selama proses perbaikan, atau untai DNA mutan dan protein anil untai tunggal (SSAP) dapat dimasukkan ke dalam sel yang mereplikasi sehingga SSAP memasukkan untai mutan ke dalam DNA sel anak.

“Kami membayangkan bahwa retron harus memberi kami kemampuan untuk menghasilkan ssDNA di dalam sel yang ingin kami edit daripada mencoba memaksanya masuk ke dalam sel dari luar, dan tanpa merusak DNA asli, yang keduanya merupakan kualitas yang sangat menarik,” kata rekannya. -Penulis pertama Daniel Goodman, Ph.D., mantan Peneliti Pascasarjana di Wyss Institute yang sekarang menjadi Rekan Pascadoktoral Jane Coffin Childs di UCSF.

Daya tarik retron lainnya adalah bahwa urutannya sendiri dapat berfungsi sebagai “kode batang” yang mengidentifikasi individu mana di dalam kumpulan bakteri yang telah menerima setiap urutan retron, memungkinkan layar gabungan yang lebih cepat dan lebih cepat dari strain mutan yang dibuat dengan tepat.

Untuk melihat apakah mereka benar-benar dapat menggunakan retron untuk mencapai rekombinasi yang efisien dengan retron, Schubert dan rekan-rekannya pertama kali membuat plasmid sirkuler DNA bakteri yang mengandung gen resistensi antibiotik yang ditempatkan dalam sekuens retron, serta gen SSAP untuk memungkinkan integrasi sekuens retron ke dalam genom bakteri. Mereka memasukkan plasmid retron ini ke dalam bakteri E. coli untuk melihat apakah gen tersebut berhasil diintegrasikan ke dalam genomnya setelah 20 generasi replikasi sel. Awalnya, kurang dari 0,1% E. coli yang membawa sistem rekombinasi retron memasukkan mutasi yang diinginkan.

Untuk meningkatkan kinerja awal yang mengecewakan ini, tim membuat beberapa perubahan genetik pada bakteri tersebut. Pertama, mereka menonaktifkan mesin perbaikan ketidakcocokan alami sel, yang mengoreksi kesalahan replikasi DNA dan karena itu dapat “memperbaiki” mutasi yang diinginkan sebelum mereka dapat diteruskan ke generasi berikutnya. Mereka juga menonaktifkan dua gen bakteri yang mengkode eksonuklease – enzim yang menghancurkan ssDNA yang mengambang bebas. Perubahan ini secara dramatis meningkatkan proporsi bakteri yang memasukkan sekuens retron, menjadi lebih dari 90% populasi.

Tag nama untuk mutan

Sekarang mereka yakin bahwa retron ssDNA mereka dimasukkan ke dalam genom bakteri mereka, tim menguji apakah mereka dapat menggunakan retron sebagai “jalan pintas” pengurutan genetik, yang memungkinkan banyak percobaan dilakukan dalam campuran. Karena setiap plasmid memiliki sekuens retron uniknya sendiri yang dapat berfungsi sebagai “label nama”, mereka beralasan bahwa mereka harus dapat mengurutkan retron yang jauh lebih pendek daripada seluruh genom bakteri untuk menentukan mutasi mana yang telah diterima sel.

Pertama, tim menguji apakah RLR dapat mendeteksi mutasi resistensi antibiotik yang diketahui pada E coli. Mereka menemukan bahwa itu bisa – retron urutan yang mengandung mutasi ini hadir dalam proporsi yang jauh lebih besar dalam data urutannya dibandingkan dengan mutasi lainnya. Tim juga menentukan bahwa RLR cukup sensitif dan tepat untuk mengukur perbedaan kecil dalam resistensi yang dihasilkan dari mutasi yang sangat mirip. Yang terpenting, mengumpulkan data ini dengan mengurutkan kode batang dari seluruh kumpulan bakteri daripada mengisolasi dan mengurutkan mutan individu, secara dramatis mempercepat prosesnya.

Kemudian, para peneliti mengambil RLR satu langkah lebih jauh untuk melihat apakah itu dapat digunakan pada DNA yang terfragmentasi secara acak, dan mencari tahu berapa banyak reton yang dapat mereka gunakan sekaligus. Mereka memotong genom strain E. coli yang sangat resisten terhadap antibiotik lain, dan menggunakan fragmen tersebut untuk membangun perpustakaan yang terdiri dari puluhan juta urutan genetik yang terkandung dalam rangkaian retron dalam plasmid. “Kesederhanaan RLR benar-benar bersinar dalam eksperimen ini, karena memungkinkan kami untuk membangun perpustakaan yang jauh lebih besar daripada yang dapat kami gunakan saat ini dengan CRISPR, di mana kami harus mensintesis baik panduan maupun urutan DNA donor untuk menginduksi setiap mutasi,” kata Schubert.

Perpustakaan ini kemudian dimasukkan ke dalam strain E coli yang dioptimalkan RLR untuk analisis. Sekali lagi, para peneliti menemukan bahwa reton yang memberikan resistensi antibiotik dapat dengan mudah diidentifikasi oleh fakta bahwa mereka diperkaya dibandingkan dengan yang lain ketika kumpulan bakteri itu diurutkan.

“Mampu menganalisis kumpulan, kumpulan mutan barcode dengan RLR memungkinkan jutaan eksperimen dilakukan secara bersamaan, memungkinkan kami untuk mengamati efek mutasi di seluruh genom, serta bagaimana mutasi tersebut mungkin berinteraksi satu sama lain,” kata penulis senior George Church, yang memimpin Area Fokus Sintetis Biologi Institut Wyss dan juga seorang Profesor Genetika di HMS. “Pekerjaan ini membantu menetapkan peta jalan menuju penggunaan RLR dalam sistem genetik lain, yang membuka banyak kemungkinan menarik untuk penelitian genetik di masa depan.”

Ciri lain yang membedakan RLR dari CRISPR adalah bahwa proporsi bakteri yang berhasil mengintegrasikan mutasi yang diinginkan ke dalam genomnya meningkat seiring waktu saat bakteri bereplikasi, sedangkan metode “satu tembakan” CRISPR cenderung berhasil atau gagal pada percobaan pertama. RLR berpotensi dapat digabungkan dengan CRISPR untuk meningkatkan kinerja pengeditannya, atau dapat digunakan sebagai alternatif di banyak sistem di mana CRISPR beracun.

Lebih banyak pekerjaan yang harus dilakukan pada RLR untuk meningkatkan dan menstandarisasi tingkat pengeditan, tetapi kegembiraan tumbuh tentang alat baru ini. Sifat RLR yang sederhana dan efisien dapat memungkinkan studi tentang bagaimana beberapa mutasi berinteraksi satu sama lain, dan menghasilkan sejumlah besar titik data yang memungkinkan penggunaan pembelajaran mesin untuk memprediksi efek mutasi lebih lanjut.

“Alat biologi sintetik baru ini membawa rekayasa genom ke tingkat keluaran yang lebih tinggi, yang niscaya akan mengarah pada inovasi baru, menarik, dan tak terduga,” kata Don Ingber, MD, Ph.D., Direktur Pendiri Wyss Institute. Ingber juga adalah Profesor Biologi Vaskular Judah Folkman di HMS dan Rumah Sakit Anak Boston, dan Profesor Bioteknologi di Sekolah Teknik dan Sains Terapan Harvard John A. Paulson.

Penulis tambahan dari makalah ini termasuk Timothy Wannier dari HMS, Divjot Kaur dari Universitas Warwick, Fahim Farzadfard dan Timothy Lu dari Institut Teknologi Massachusetts, dan Seth Shipman dari Institut Ilmu Data dan Bioteknologi Gladstone.

Penelitian ini didukung oleh Departemen Energi Amerika Serikat (DE-FG02-02ER63445) dan oleh National Defense Science and Engineering Graduate Fellowship.

Untuk Informasi Lebih lanjut silahkan Kunjungi : Lagu Togel